一种用于防治草地贪夜蛾的多元纳米复合物及其制备方法与应用-9479威尼斯

专利名称：一种用于防治草地贪夜蛾的多元纳米复合物及其制备方法与应用

专利类型：发明专利

专利申请号：cn202311451926.8

专利申请（专利权）人：中国农业大学三亚研究院
权利人地址：海南省三亚市崖州区崖州湾科技城标准厂房二期三楼

专利发明（设计）人：沈杰,闫硕,张雷,赵佳佳,胡梦凡,李明键

主权利要求：1.一种用于防治草地贪夜蛾的多元纳米复合物，其特征在于，包括以下成分：农药、载体spc和dsnrf2，nrf2基因的核苷酸序列如seqidno:1所示；dsnrf2与农药spc复合物的质量比为2 1:1 4；所述农药为氯虫苯甲酰胺或乙基多杀菌素；所述载体spc为星型阳离子聚~ ~合物；
所述载体spc的结构式为： 。
2.根据权利要求1所述的用于防治草地贪夜蛾的多元纳米复合物，其特征在于，所述dsnrf2通过体外转录法或体内载体表达法制得；所述体外转录法包括以下步骤：利用含有t7启动子序列的引物，采用pcr扩增nrf2基因片段，以扩增的产物为模板，转录合成dsnrf2。
3.根据权利要求2所述的用于防治草地贪夜蛾的多元纳米复合物，其特征在于，氯虫苯甲酰胺、spc、dsnrf2的终浓度为1：300：300μg/ml；乙基多杀菌素、spc、dsnrf2的终浓度为
6:300:300μg/ml。
4.权利要求1‑3任一项所述的用于防治草地贪夜蛾的多元纳米复合物的制备方法，其特征在于，将农药与载体spc混合，然后加入dsnrf2混合。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将农药与载体spc混合，再加入经溶菌酶处理的表达dsnrf2的工程菌，混合，即得所述多元纳米复合物。
6.权利要求1‑3任一项所述的多元纳米复合物在制备用于防治草地贪夜蛾的产品中的应用。
7.权利要求1‑3任一项所述的多元纳米复合物在玉米叶片保护中的应用。 说明书 : 一种用于防治草地贪夜蛾的多元纳米复合物及其制备方法与
应用技术领域[0001] 本发明涉及害虫防治技术领域，具体涉及一种用于防治草地贪夜蛾的多元纳米复合物及其制备方法与应用。背景技术[0002] 近70年前，农药研究在防治害虫方面取得了首次重大成功，促进了农业生产的稳定，以满足全球粮食需求。然而，农药的过度使用使得昆虫对几乎所有种类的商业农药都具有严重的抗药性。据报道，多种昆虫对杀虫剂产生抗性的机制包括代谢和排泄增强、靶点不敏感、角质层渗透减少和回避行为，在这些机制中，杀虫剂代谢是一个复杂的生理过程，涉及到由于基因多态性或解毒基因的组成性过表达而引起的酶活性的变化。细胞色素p450（p450）、谷胱甘肽s转移酶（gst）、udp‑葡萄糖醛基转移酶、羧化酯酶和atp结合盒（abc）跨膜转运蛋白等酶是这一过程不可或缺的组成部分，在每个酶家族中都发现了大量的解毒基因。[0003] rna干扰（rnai）被认为是一种很有前途的生态友好型害虫治理策略。通过rnai靶向解毒基因已成为提高杀虫剂敏感性和控制抗药性的流行策略。然而，由于解毒基因的多样性，解决广谱代谢抗性仍然具有挑战性。探索更有效、更强大的靶基因势在必行。不幸的是，鳞翅目昆虫由于酶解和有限的细胞摄取而对双链rna（dsrna）不敏感，这限制了rnai在害虫管理中的应用。在过去的20年里，各种纳米递送系统被设计用于高效的dsrna递送。本申请团队开发了一种以星状阳离子（spc）为中心的纳米递送平台（参见cn108794710a），用于害虫防治。spc中带正电叔胺的疏水核和亲水壳为dsrna和有机化合物提供了丰富的结合位点。该平台不仅可以保护dsrna不被rnase降解，还可以通过激活内吞途径打破递送瓶颈。因此，利用基于纳米载体spc的dsnrf2和农药的共传递系统，有望开发一种新型的多组分纳米农药来控制广谱代谢耐药性。[0004] 草地贪夜蛾（spodopterafrugiperda）是一种全球性的主要入侵害虫，已成为玉米及水稻、小麦、大豆、棉花等重要作物粮食安全的主要威胁，造成了巨大的经济损失。目前推荐使用氯虫苯甲酰胺chlorantraniliprole（chl）、苯甲酸emamectinbenzoate（emb）和乙基多杀菌素spinetoram（sp）进行草地贪夜蛾治理。虽然化学杀虫剂在草地贪夜蛾的治理中发挥了至关重要的作用，但这种害虫已经对至少29种杀虫活性成分产生了抗药性，跨越了6种群体模式。这种抗性通常与代谢抗性相关的基因家族的过度表达有关。发明内容[0005] 本发明旨在提供一种用于防治草地贪夜蛾的多元纳米复合物及其制备方法与应用，以有效对抗草地贪夜蛾的广谱代谢抗性。[0006] 为了达到上述目的，我们首先证明了nrf2作为草地贪夜蛾中各种解毒基因的调节剂，调节p450和gst的活性的潜力。在此基础上，构建了sp/spc/dsnrf2复合物，展示了其自组装机理并对其性质进行了表征。体外和体内实验验证了基于spc的纳米递送系统对dsrna的高效递送和rnai有效性。最后，将细菌表达系统与纳米递送系统相结合，构建了一种新型的多组分纳米农药。[0007] 本发明的主要技术方案包括：[0008] 一种用于防治草地贪夜蛾的多元纳米复合物，包括以下成分：农药、载体spc和dsnrf2，nrf2基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。[0009] 优选的，所述农药包括氯虫苯甲酰胺、苯甲酸或乙基多杀菌素。[0010] 优选的，所述dsnrf2通过体外转录法或体内载体表达法制得；所述体外转录法包括以下步骤：利用含有t7启动子序列的引物，采用pcr扩增nrf2基因片段，以扩增的产物为模板，转录合成dsnrf2。[0011] 优选的，所述载体spc为星型阳离子聚合物。[0012] 优选的，dsnrf2与农药spc复合物的质量比为2 1:1 4。~ ~[0013] 优选的，所述氯虫苯甲酰胺、spc、dsnrf2的终浓度为1：300：300μg/ml；乙基多杀菌素、spc、dsnrf2的终浓度为6:300:300μg/ml。[0014] 进一步的，本发明提供了所述的用于防治草地贪夜蛾的多元纳米复合物的制备方法，其步骤在于：将农药与载体spc混合，然后加入dsnrf2混合。[0015] 优选的，所述制备方法的步骤为：将农药与载体spc混合，再加入经溶菌酶处理的表达dsnrf2的工程菌，混合，即得所述多元纳米复合物。[0016] 另一方面，本发明还涉及所述的多元纳米复合物在制备用于防治草地贪夜蛾的产品中的应用。以及，所述的多元纳米复合物在植物叶片保护中的应用。[0017] 与现有技术相比，本发明的有益成果在于：[0018] 本发明首次将纳米递送系统应用于dsrna和农药的共递送，为设计高效的农药/药物提供了一种新颖而通用的策略。[0019] 本发明开发了一种新型自组装多元纳米农药（农药/spc/dsnrf2复合物），具有良好的叶片保护效果和防治效果。农药/spc/dsnrf2复合物的杀虫活性显著提高，标准化协同比为5.43‑15，其施用剂量可降低至单独施用剂量的9.08% 26.48%。~[0020] 本发明为广谱代谢抗性的可持续管理提供了一个新的rnai靶点，在环境友好型农业中具有很大的应用前景。附图说明[0021] 图1：饲喂dsnrf248h后nrf2在草地贪夜蛾中的表达。[0022] 图2：nrf2干扰下调后的解毒基因p450s、gsts的酶活性。[0023] 图3：nrf2干扰下调后的解毒基因的表达。[0024] 图4：农药/纳米载体/dsrna复合物的组装机理示意图。[0025] 图5：琼脂糖凝胶阻滞实验结果。[0026] 图6：通过动态光散射（dls）和透射电子显微镜（tem）研究的各种复合物的粒径。[0027] 图7：杀虫活性测定结果。[0028] 图8：采用pet28‑bl21(de3)rnaseiii‑表达系统大规模生产dsnrf2的过程示意图。[0029] 图9、图10：多元纳米农药对玉米叶片的保护效果。具体实施方式[0030] 为使本领域技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。[0031] 实验例：[0032] 1方法[0033] 1.1草地贪夜蛾dsnrf2的合成与干扰[0034] 为了合成dsnrf2，我们在中国湖北省武汉的玉米田采集了草地贪夜蛾幼虫，利用rnasimpletotalrnakit（天根生物科技有限公司）试剂盒提取总rna，以rna为模板，按照primescript™rtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)试剂盒说明书（takara，大连）反转录合成单链cdna。根据ncbi数据库中草地贪夜蛾nrf2基因的序列（genbankaccessionnumber:jn164650.1,2012年10月31日），在其编码区设计带t7启动子序列的引物。[0035] t7‑dsnrf2‑f:t7‑ctcggagacgaggctgatac（seqidno:2）[0036] t7‑dsnrf2‑r:t7‑agactggagaaacccgtcct（seqidno:3）[0037] 利用含有t7启动子序列的引物，采用聚合酶链反应(pcr)扩增nrf2基因片段。以扩增的产物为模板，使用megascriptt7transcriptionkit（invitrogen）转录试剂盒合成dsnrf2。[0038] 将100只新孵化的幼虫饥饿12h后，饲喂含有dsnrf2（15μg/g,w/w）的人工饲料48h，以靶向增殖型绿色荧光蛋白（egfp）基因的dsegfp为对照。每次处理提取3个独立样本的总rna，合成cdna，采用实时荧光定量pcr（qrt‑pcr）分析nrf2的干扰情况。[0039] qpcr‑nrf2‑f：cagcacgatccactctactatcag（seqidno:4）[0040] qpcr‑nrf2‑r：ccagcattcgcattgtgtac（seqidno:5）[0041] 1.2验证nrf2功能的解毒基因表达和酶活性分析[0042] 为了探讨nrf2在代谢抗性中的调节作用，我们检测了nrf2干扰下调后的解毒基因p450s、gsts的表达和酶活性。选择14个解毒基因进行qrt‑pcr表达分析。分别为sfru019975（genbankaccessionnumber:xm_035591457.2,2022年9月21日）、sfru018366（genbankaccessionnumber:xm_035599646.2,2022年9月21日）、sfru018468（genbankaccessionnumber:xm_035599451.2,2022年9月21日）、sfru009129（genbankaccessionnumber:xm_035583148.2,2022年9月21日）、sfru018587（genbankaccessionnumber:xm_035599451.2,2022年9月21日）、sfru005107（genbankaccessionnumber:xm_035587190,2022年9月21日）、sfru020240（genbankaccessionnumber:mz945594.1,2022年9月21日）、sfru000232（genbankaccessionnumber:xm_035586487,2022年9月21日）、sfru008242（genbankaccessionnumber:mz945674,2022年3月1日）、sfru014770（genbankaccessionnumber:xr_007705484,2022年9月21日）、sfru002492（genbankaccessionnumber:xm_050701549,2022年9月21日）、sfru006603（genbankaccessionnumber:xm_035581543 ,2022年9月21日）、sfru016466（genbankaccessionnumber:xm_050693815,2022年9月21日）、sfru019031（genbankaccessionnumber:mz673639,2022年3月20日）。所述14个解毒基因的基因序列依序如seqidno：10 seqidno：23所示。~[0043] 接下来检测了dsnrf2和dsegfp处理后幼虫的解毒酶活性。将处理后的幼虫在1ml冰冷的磷酸钠缓冲液中研磨均匀，4℃离心后获得酶溶液。p450s活性通过硝基苯甲醚（pna）o‑去甲基化测定，将90μl酶溶液和100μl2mmpna在30℃下孵养3min，加入10μl(9.6mm)nadph（还原型辅酶ⅱ）开始反应15min，用酶标仪（spectramaxplus384,moleculardevices）测定405nm处的吸光度。以1‑氯2,4‑二硝基苯（cdnb）（默克sigma‑aldrich）为底物，测定gsts（谷胱甘肽巯基转移酶）活性。将136μlpbs、60μl30mm还原性谷胱甘肽（gsh）、4μl30mmcdnb和100μl100倍稀释的酶溶液孵育，加入cdnb开始反应。在初始5min处测定340nm处的吸光度。以牛血清白蛋白（bsa）为标准蛋白，采用考马斯亮蓝法测定酶溶液的总蛋白含量。每种解毒酶活性的测定重复进行三次。[0044] 1.3农药/纳米载体/dsrna复合物的组装机理及表征分析[0045] 等温滴定量热法(itc)能准确反映两种物质相互作用时的主导作用力，采用等温滴定量热法研究杀虫剂与spc的相互作用。在nanoitc(tainstrumentswaters)中用1mmol/l的spc水溶液（spc为一种星型阳离子聚合物，图4展示了其结构，专利文献cn114478735a、cn108794710a也记载了其结构和制备方法，按照公开号为cn108794710a的中国发明专利中实施例2所示的方法制备。）滴定0.138mmol/l的chl（氯虫苯甲酰胺）。通过origin7软件(originlabco.)分析了相互作用热。试验温度为25℃，δg的计算方法为 δg= δh‑tδs。为了进一步确认dsrna与农药/spc复合物的结合，将dsegfp（基因egfp的dsrna）与chl/spc复合物分别按2:0、2:1、1:1、1:2和1:4(dsegfp:spc)的质量比孵育，并对每种混合物进行琼脂糖凝胶阻滞试验。[0046] 在农药/spc/dsrna复合物制备中，根据载药量（plc）将chl与spc混合，再与dsegfp以1：1的质量比孵育（spc:dsegfp）。使用dls（malverninstrumentsltd.）在25℃下分析chl(1mg/ml)、chl/spc复合物（sp浓度:1mg/ml）和chl/spc/dsegfp复合物（chl浓度:0.5mg/ml）的粒径，并使用透射电子显微镜（jeol‑1200）进一步观察其形态。[0047] 载药量(plc)的计算公式为pcl(%)=复合物中载药量÷农药/spc复合物的重量×100%。[0048] 为了定量chl/spc/dsegfp复合物中的chl，将chl/spc复合物与dsegfp按1:1的质量比（spc:dsegfp）混合透析12h，超高效液相色谱法测定透析袋外chl的浓度，并计算chl/spc/dsegfp络合物中的chl质量。[0049] 1.4工程菌高效表达dsnrf2[0050] 采用pet28‑bl21(de3)rnaseiii‑表达系统对dsnrf2进行了规模化表达。对nrf2基因设计带酶切位点的引物，然后构建到pet28a载体中，然后在bl21(de3)rnaseiii‑（它是在bl21(de3)菌株的基础上敲除了rnaseiii）表达系统中表达。挑取过夜培养的单个菌落，在lb培养基中振荡培养，od600nm=0.4左右时加入异丙基β‑d‑硫代半乳糖苷（iptg）（北京索莱宝科技有限公司）（1mm）表达dsnrf2。在培养基中加入溶菌酶至终浓度为1.3mg/ml，使细胞壁破壁，然后在75℃下放置5min，杀死剩余的细菌。表达的dsnrf2用rnacleankit(tiangenco.)纯化，用nanodrop2000分光光度计(thermofisherscientific)定量。[0051] pet‑ecorinrf2‑sf:cggaattcctcggagacgaggctgatac（seqidno:6）[0052] pet‑xbalnrf2‑sr:gctctagaagactggagaaacccgtcct（seqidno:7）[0053] pet‑xbalnrf2‑af:gctctagaagagtgggtgtggtgaggc（seqidno:8）[0054] pet‑xholnrf2‑ar:ccgctcgagctcggagacgaggctgatac（seqidno:9）[0055] 1.5农药/spc/dsrna复合物的生物活性测定[0056] 根据农药chl、sp外用亚致死浓度，将chl、sp分别与spc混合，再与dsnrf2孵育，制备chl/spc/dsnrf2（终浓度1：300：300μg/ml）、sp/spc/dsnrf2（终浓度6:300:300μg/ml）。分别将0.5μlchl/spc/dsnrf2、sp/spc/dsnrf2复合物对3龄幼虫进行生物活性测定。还测试了各种配方，如单独农药、农药/spc复合物、农药/spc/dsegfp复合物、dsegfp、dsnrf2、dsegfp/spc复合物和dsnrf2/spc复合物。分别于用药后12、24、36、48h记录死亡率。每个处理20只幼虫，重复3次。采用chl/spc复合物处理幼虫的死亡率÷单独农药chl处理幼虫平均死亡率的公式评价协同效应。[0057] 将面积为2cm2的玉米叶片分别浸泡在1ml的纳米载体spc、单独农药、农药/spc复合物、农药/spc/dsegfp复合物、农药/spc/dsnrf2复合物溶液中60s，风干30s，然后用于喂养新孵化的草地贪夜蛾幼虫。36h后测定玉米叶片的被取食情况。[0058] 2结果[0059] 2.1抗性管理的优良靶基因[0060] 农药的过度使用导致草地贪夜蛾对几乎所有商业农药配方的抗性迅速发展，迫切需要新的解毒基因来控制代谢抗性。nrf2基因水平的干扰可改变解毒基因的表达，使其成为提高杀虫剂敏感性的一个极好的候选基因。为了研究nrf2在昆虫代谢抗性中的潜在功能，我们首先通过口服饲喂下调其在草地贪夜蛾中的表达(图1)，为了进一步证实nrf2rnai对p450s和gsts基因表达的影响，我们选择了14个靶基因进行qrt‑pcr表达分析，所有检测基因均显著下调（图3）。同时，dsnrf2处理的草地贪夜蛾的p450和gsts活性分别从0.159nmol/min/mg∙pro下降到0.098nmol/min/mg∙pro，0.288μmol/min/mg∙pro下降到0.199μmol/min/mg∙pro（图2）。因此，nrf2被认为是一种有希望的靶点，可以提高草地贪夜蛾对杀虫剂的敏感性和控制抗性。[0061] 2.2农药/spc/dsrna复合物的自组装机制及表征[0062] 为了确定spc与杀虫剂之间的相互作用，农药chl用spc溶液滴定，进行等温滴定量热法（itc）测定。根据之前对itc数据的解释，高亲和常数（ka）和低解离常数（kd）表明spc与杀虫剂之间存在有效和强的相互作用。负的δg值表明了这些相互作用的自发性质。δh和δs的正值表明疏水缔合是chl/spc复合物自组装的驱动力。[0063] 为了进一步研究农药chl/spc复合物与dsrna的结合作用，以chl为例，制备了纯chl/spc复合物，并用dsegfp水溶液进行滴定。itc数据显示，chl/spc复合物与dsegfp的进一步结合是通过氢键和范德华力实现的。琼脂糖凝胶阻滞实验也表明，静电相互作用也有助于多组分复合物的自组装（图5）。spc的化学结构有助于通过疏水缔合将chl装载到其核心，而spc侧链上的质子化氨基则参与静电吸收并与dsrna形成氢键（图4）。此外，为了定量chl/spc/dsegfp复合物中的chl，将chl/spc复合物与dsegfp按1:1的质量比(spc:dsegfp)混合透析12h，并使用uplc测定透析袋外chl的浓度。计算chl:spc:dsegfp的质量比为10:45:45。[0064] 分别用动态光散射（dls）和透射电子显微镜（tem）研究了各种复合物的粒径和表征。与spc的结合破坏了被测农药（chl）的自聚集结构，导致颗粒粒径显著减小（图6）。如图6所示，chl由均匀粒径为1586nm的菱形粒子转变为115nm的稳定球形粒子。在chl/spc/dsegfp复合物中，加入dsrna后的粒径增加到202nm。根据目前的数据，dsrna被静电作用粘附在chl/spc复合物的表面。[0065] 2.3多元纳米农药的生物活性测定[0066] 根据农药亚致死浓度和化学合成的dsnrf2配制各种配方，包括农药/spc复合物、农药/spc/dsnrf2复合物等。通过局部应用研究了上述制剂的生物活性。正如预期的那样，亚致死浓度的农药chl（氯虫苯甲酰胺）、sp（乙基多杀菌素）对幼虫有轻微的致死作用（图7）。而在spc的帮助下，它们的杀虫活性显著提高，农药chl/spc、sp/spc复合物的归一化增效比分别为3.00‑4.75、2.00‑4.25（图7）。令人兴奋的是，农药/spc/dsnrf2复合物显示出最强的致死效应，与单独使用农药相比，其标准化协同比为5.43‑6.25(chl)、6.75‑15.00(sp)（图7）。农药chl/spc/dsnrf2、sp/spc/dsnrf2复合物施药剂量分别为单独施药剂量的9.08%、26.48%。基于目前的研究结果，spc可以通过实现农药纳米化和抑制nrf2表达来提高杀虫活性。[0067] 为研究多元纳米农药对玉米叶片的保护作用，将玉米叶片浸泡在多元纳米农药复合物中，然后饲喂幼虫。如图9‑图10所示，chl/spc复合物的保护作用强于单独的chl。更重要的是，多元纳米农药（chl/spc/dsnrf2复合物）的叶片保护效果最好，保护叶面积比例最高（48h:93.60%）。正如预期的那样，sp/spc/dsnrf2复合物也表现出较好的叶片保护效果。由于其强大的基于spc的纳米递送系统，nrf2是开发具有良好叶片保护效果和控制效果的多组分纳米农药的理想靶点。[0068] 以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：海南

专利申请日期：2023-11-03

专利公开日期：2024-02-23

专利公告号：cn117178996b