一种天伦兜兰的种子组织培养繁殖方法及培养基-9479威尼斯

专利名称：一种天伦兜兰的种子组织培养繁殖方法及培养基

专利类型：发明专利

专利申请号：cn202310660817.0

专利申请（专利权）人：广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所
权利人地址：广西壮族自治区桂林市雁山

专利发明（设计）人：付传明,黄宁珍,冼康华,何金祥,刘宝骏,苏江

专利摘要：本发明公开了一种天伦兜兰的种子组织培养繁殖方法及培养基，属于植物组织培养技术领域。本发明所述方法包括以下步骤：在天伦兜兰原生居群中进行人工授粉结实，采收适龄蒴果进行无菌播种、愈伤组织或类原球茎的诱导、增殖和分化培养、壮苗与生根培养，炼苗移栽后获得天伦兜兰种苗。本发明方法具有授粉结实率高、繁殖速度快、种苗品质好等优点，可用于极小种群野生植物天伦兜兰的规模化种苗繁殖，促进资源保护和可持续利用。

主权利要求：
1.一种天伦兜兰的种子组织培养繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
采收成熟度150～210dap的天伦兜兰蒴果，经表面消毒后将内部种子接种于萌发培养基上进行萌发培养，得到原球茎，不转接继续培养，原球茎分化形成芽苗；所述萌发培养基为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.5～3.5mg/l 萘乙酸0.1～0.5mg/l 香蕉30～50g/l 活性炭0.5～1.5g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；
将所述芽苗接种于壮苗与生根培养基上进行壮苗与生根培养，获得完整植株；所述壮苗与生根培养基为：1/2ms 萘乙酸0.2～1.0mg/l 香蕉50～100g/l 蛋白胨1.0～2.0g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在天伦兜兰花朵开放的第5～15d，在晴朗天气上午的8～10点进行人工异花授粉获得蒴果。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面消毒具体为：清洗掉蒴果表面的灰尘和杂物，然后用体积分数70～80％的酒精浸泡60～90s，无菌水漂洗1次，再用有效氯含量为2～3％的次氯酸钠溶液浸泡15～20min，无菌水漂洗4～5次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萌发培养时，种子萌发阶段采用遮光培养，遮光率为80～100％；原球茎形成和分化阶段采用弱散射光照培养，光照强度为500～
1000lx，光照时间为10～16h/d；
所述壮苗与生根培养的光照强度为1500～3000lx，光照时间为10～16h/d。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萌发培养后还包括：
将所述芽苗切成带顶芽和茎基的芽段，接种到诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织或类原球茎；所述诱导培养基为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤0.5～1.0mg/l 2,4‑二氯苯氧乙酸0.5～2.5mg/l 香蕉10～30g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；
将愈伤组织或类原球茎转接到继代增殖培养基中进行继代增殖培养，所述继代增殖培养基为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0～4.0mg/l 吲哚丁酸0.1～0.3mg/l 香蕉10～30g/l 蔗糖
20～30g/l，ph值为5.4～6.2；
将继代增殖后的愈伤组织或类原球茎切割成块后接种到分化培养基上进行分化培养获得芽苗，所述分化培养基为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0～3.0mg/l 吲哚丁酸0.1～0.5mg/l 椰汁80～150ml/l 硝酸银0.5～1.0mg/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～
6.2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述继代增殖培养为液体振荡培养，振荡速度为50～110r/min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导培养、继代增殖培养与分化培养使用的光环境为弱散射光照培养，光照强度为500～1000lx，光照时间为10～16h/d。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天伦兜兰完整植株经炼苗后出瓶移栽，所述移栽的栽培基质为体积比1：1：1～3的植金石、珍珠岩和松树皮。
9.一种天伦兜兰组织培养用培养基，其特征在于，包括：
萌发培养基：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.5～3.5mg/l 萘乙酸0.1～0.5mg/l 香蕉30～50g/l 活性炭0.5～1.5g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；
壮苗与生根培养基：1/2ms 萘乙酸0.2～1.0mg/l 香蕉50～100g/l 蛋白胨1.0～2.0g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2。
10.根据权利要求9所述天伦兜兰组织培养用培养基，其特征在于，还包括：
诱导培养基：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤0.5～1.0mg/l 2,4‑二氯苯氧乙酸0.5～2.5mg/l 香蕉10～30g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；
继代增殖培养基：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0～4.0mg/l 吲哚丁酸0.1～0.3mg/l 香蕉10～30g/l 蔗糖20～30g/l，ph值为5.4～6.2；
分化培养基：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0～3.0mg/l 吲哚丁酸0.1～0.5mg/l 椰汁80～
150ml/l 硝酸银0.5～1.0mg/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2。 说明书 : 一种天伦兜兰的种子组织培养繁殖方法及培养基技术领域[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种天伦兜兰无菌播种萌发的组织培养快速繁殖方法及培养基。背景技术[0002] 天伦兜兰[paphiopedilumtranlienianumo.gruss&perner]别名陈莲兜兰，为兰科(orchidaceae)兜兰属多年生植物，在我国仅分布于云南东南部的麻栗坡县，生长于石灰岩地区灌木林下的岩壁上或岩石凹槽中，分布地域十分狭窄，生境特殊。目前，天伦兜兰为我国i级重点保护植物，同时也被《全国极小种群野生植物拯救保护工程规划(2011‑2015年)》收录，列为首批急需优先抢救的国家重点保护濒危植物之一。[0003] 天伦兜兰花形独特，向前覆盖的中萼片白色非常明显，基部略有绿色斑纹；花瓣平展呈波浪状，具有白色的边纹和紫褐色唇囊形成明显对比，整体花色靓丽迷人，是开发高档花卉和培育花卉新品种难得的好材料，具有十分重要的科研价值和经济价值。[0004] 对极小种群野生植物天伦兜兰进行种苗繁育，是实现对其资源保护和可持续利用的前提。目前，兜兰属植物人工繁殖多采用无菌播种的方法，通常是在人工营养培养基中加入适宜浓度的植物生长调节剂以及添加物等，可有效促进种子的萌发，然后结合继代增殖、壮苗和生根培养等组织培养技术繁殖获得再生植株。尽管目前已攻克了数十种兜兰属植物的无菌播种快繁技术，但兜兰属仍然是兰科植物中繁殖最困难的属之一，且兜兰属不同种类或类型的无菌播种繁殖技术并不相同，种子萌发、增殖扩繁等技术方法均需进一步的试验和研究。天伦兜兰自然生长条件下极少结实，但人工授粉能够获得饱满蒴果，且每个蒴果通常可含数万粒种子，因此采用种子大规模繁殖种苗具有诱人的前景。[0005] 极小种群野生植物大都分布范围狭窄、个体数量稀少且自然更新困难，面临随时灭绝的风险，已成为当前中国生物多样性保护的一个热点方向。近年来，为拯救保护我国最受威胁的植物种类，我国已经启动实施了若干国家、省级保护行动和保护研究项目。7种兜兰属极小种群野生植物中，海伦兜兰、白花兜兰等已有学者通过无菌播种和组织培养方式实现资源再生，解决了种苗繁殖技术问题，并为回归自然试验和园艺生产提供了大量的材料，但唯独天伦兜兰尚未见繁殖技术研究的报道。发明内容[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种天伦兜兰的种子组织培养繁殖方法及培养基。本发明提供的方法授粉结实率高、繁殖速度快、种苗品质好，可用于天伦兜兰的规模化种苗繁殖，促进资源保护和可持续利用。[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：[0008] 本发明提供了一种天伦兜兰的种子组织培养繁殖方法，包括以下步骤：[0009] 采收成熟度150～210dap的天伦兜兰蒴果，经表面消毒后将内部种子接种于萌发培养基上，萌发培养得到原球茎及芽苗；[0010] 所述萌发培养基为：1/2～1/4ms 6‑苄基腺嘌呤1.5～3.5mg/l 萘乙酸0.1～0.5mg/l 香蕉30～50g/l 活性炭0.5～1.5g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；[0011] 将芽苗接种于壮苗与生根培养基上，培养获得完整植株；[0012] 所述壮苗与生根培养基为：1/2ms 萘乙酸0.2～1.0mg/l 香蕉50～100g/l 蛋白胨1.0～2.0g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2。[0013] 优选的，在天伦兜兰原生居群中，选择盛花期的开花株进行人工授粉获得蒴果；进一步优选的，盛花期为天伦兜兰花朵开放的第5～15d。[0014] 进一步优选的，所述人工授粉为异花授粉，是以不同开花株为父母亲本，用洁净牙签将父本花朵花粉涂抹在母本花朵柱头凹槽内，人工授粉选择在晴朗天气上午的8～10点进行。[0015] 优选的，所述表面消毒具体为：先将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数70～80％的酒精浸泡60～90s，无菌水漂洗1次，再用有效氯含量为2～3％的次氯酸钠溶液浸泡15～20min，无菌水漂洗4～5次。[0016] 优选的，所述萌发培养为一步培养，包括种子萌发阶段、原球茎形成和分化阶段。所述种子萌发培养使用的光环境为用黑色遮光布进行遮光培养，遮光率为80～100％；原球茎形成和分化培养使用的光环境为弱散射光照培养，光照强度为500～1000lx，光照时间为10～16h/d；培养温度为23～27℃，环境湿度为60～70％[0017] 优选的，所述萌发培养后还包括愈伤组织或类原球茎的诱导、继代增殖与分化培养的步骤。[0018] 所述愈伤组织或类原球茎的诱导具体为：将芽苗接种到诱导培养基中，培养获得愈伤组织或类原球茎；[0019] 优选的，接种时还需要对芽苗进行修剪处理，包括剪掉叶片和根系，切成一个带顶芽和茎基的芽段；[0020] 所述诱导培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤0.5～1.0mg/l 2,4‑二氯苯氧乙酸0.5～2.5mg/l 香蕉10～30g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；[0021] 所述愈伤组织或类原球茎的继代增殖具体为：将愈伤组织或类原球茎接种到继代增殖培养基中，培养得到大量愈伤组织或类原球茎；[0022] 所述继代增殖培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0～4.0mg/l 吲哚丁酸0.1～0.3mg/l 香蕉10～30g/l 蔗糖20～30g/l，ph值为5.4～6.2；[0023] 优选的，所述继代增殖培养为液体振荡培养，使用的是液体培养基，置于转速50～110r/min的摇床上振荡培养。[0024] 所述愈伤组织或类原球茎的分化具体为：将愈伤组织或类原球茎接种到分化培养基上，培养获得芽苗；[0025] 所述分化培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0～3.0mg/l 吲哚丁酸0.1～0.5mg/l 椰汁80～150ml/l 硝酸银0.5～1.0mg/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；[0026] 优选的，所述愈伤组织或类原球茎的诱导、继代增殖与分化培养使用的光环境为弱散射光照培养，光照强度为500～1000lx，光照时间为10～16h/d；培养温度为23～27℃，环境湿度为60～70％。[0027] 优选的，所述壮苗与生根培养使用的光照强度为1500～3000lx，光照时间为10～16h/d；温度为23～27℃，环境湿度为60～70％。[0028] 将完整植株进行炼苗，出瓶移栽得到天伦兜兰种苗。[0029] 优选的，所述炼苗移栽季节是在每年的3～5月或10～11月，炼苗场所为设施大棚内，自然光温下炼苗10～20d。[0030] 优选的，所述出瓶移栽具体为：打开瓶盖取出植株，清水洗净根部附着的培养基，用稀释1000倍的多菌灵浸泡2～3min，阴凉处晾置6～12h后，以1～3个单株聚集成一丛栽种到育苗杯中。[0031] 优选的，所述移栽后的栽培基质包括植金石、珍珠岩和松树皮；优选的，所述植金石、珍珠岩和松树皮的体积比为1：1：1～3。[0032] 本发明还包括天伦兜兰组织培养用培养基，包括：[0033] 萌发培养基：1/2～1/4ms 6‑苄基腺嘌呤1.5～3.5mg/l 萘乙酸0.1～0.5mg/l 香蕉30～50g/l 活性炭0.5～1.5g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；[0034] 壮苗与生根培养基：1/2ms 萘乙酸0.2～1.0mg/l 香蕉50～100g/l 蛋白胨1.0～2.0g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2。[0035] 优选的，上述培养基还包括：[0036] 诱导培养基：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤0.5～1.0mg/l 2,4‑二氯苯氧乙酸0.5～2.5mg/l 香蕉10～30g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；[0037] 继代增殖培养基：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0～4.0mg/l 吲哚丁酸0.1～0.3mg/l 香蕉10～30g/l 蔗糖20～30g/l，ph值为5.4～6.2；[0038] 分化培养基：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0～3.0mg/l 吲哚丁酸0.1～0.5mg/l 椰汁80～150ml/l 硝酸银0.5～1.0mg/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2。[0039] 本发明的有益效果为：[0040] 本发明对天伦兜兰原生居群开花株进行人工授粉的结实率高达100％，选择合适胚龄的种子作为外植体材料，进行种子消毒、播种萌发、原球茎形成和分化的一步培养，可得到具1～3张叶片的芽苗，再经壮苗生根培养后，便可获得完整植物，期间结合愈伤组织或类原球茎诱导、增殖与分化培养，能快速扩充再生芽苗的数量。本发明的方法具有授粉结实率高、繁殖速度快、种苗品质好等优点，可以进行大规模繁殖天伦兜兰种苗，繁殖的种苗可用于供应市场并应用于迁地保护和自然回归，促进资源保护和可持续利用。附图说明[0041] 图1为本发明中天伦兜兰在原生境中人工授粉结实照片；[0042] 图2为本发明中天伦兜兰种子萌发照片：左为种子无菌萌发培养照片，右为电镜下观测的种子萌发形态照片；[0043] 图3为本发明中天伦兜兰原球茎分化成小苗照片；[0044] 图4为本发明中天伦兜兰愈伤组织或类原球茎的诱导、继代增殖与分化培养照片；[0045] 图5为本发明中天伦兜兰壮苗与生根培养照片；[0046] 图6为本发明中天伦兜兰出瓶移栽照片：左为出瓶移栽90d照片，右为在栽培中开花照片。具体实施方式[0047] 本发明提供了一种天伦兜兰的种子组织培养繁殖方法，包括以下步骤：[0048] 采收成熟度150～210dap的天伦兜兰蒴果，经表面消毒后将内部种子依次进行萌发培养和壮苗与生根培养，获得完整植株；[0049] 所述萌发培养基为：1/2～1/4ms 6‑苄基腺嘌呤1.5～3.5mg/l 萘乙酸0.1～0.5mg/l 香蕉30～50g/l 活性炭0.5～1.5g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；[0050] 所述壮苗与生根培养基为：1/2ms 萘乙酸0.2～1.0mg/l 香蕉50～100g/l 蛋白胨1.0～2.0g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2。[0051] 本发明在天伦兜兰原生居群中，选择盛花期的开花株进行人工授粉获得蒴果，优选为在花朵开放的第5～15d时进行授粉，更优选为在花朵开放的第5～10d时进行授粉。在本发明中所述人工授粉为异株授粉，具体为选取不同开花单株为父母亲本，把父母亲本花朵唇瓣的兜囊剪掉，然后将父本的花粉囊涂抹在母本的柱头面上，授粉后进行套袋和挂牌标记。本发明采用人工授粉的方法结实率高达100％，提高了蒴果饱满度和种子质量，进一步提高天伦兜兰种子培养的萌发率。[0052] 本发明采收成熟度为150～210dap蒴果，经表面消毒后将内部种子接种于萌发培养基上，培养得到原球茎及芽苗。在本发明中，蒴果的成熟度优选为150～210dap，更优选为170～190dap，所述成熟度是指从授粉后到采收所生长的天数(daysafterpollinatiaon，dap)来计算。[0053] 蒴果采收后需要经过表面消毒。所述表面消毒具体为：先将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数70～80％的酒精浸泡60～90s，无菌水漂洗1次，再用有效氯含量为2～3％的次氯酸钠溶液浸泡15～20min，无菌水漂洗4～5次。本发明在蒴果表面消毒时使用次氯酸钠(naclo)代替兰科植物种子常规消毒使用升汞(hgcl2)为消毒剂的方法，在达到有效消毒的同时，能提升种子萌发速度、提高萌发数量，有利于天伦兜兰种子萌发。[0054] 本发明天伦兜兰的萌发培养可以为种子在萌发培养基中一步培养，包括种子萌发阶段、原球茎形成和分化阶段。具体为：将经过消毒的种子均匀撒播于萌发培养基表面，萌发培养基为：1/2～1/4ms 6‑苄基腺嘌呤1.5～3.5mg/l 萘乙酸0.1～0.5mg/l 香蕉30～50g/l 活性炭0.5～1.5g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤2.5～3.0mg/l 萘乙酸0.2～0.3mg/l 香蕉40g/l 活性炭1.0g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8。培养40～90d得到原球茎，不转接继续培养30～60d，原球茎逐渐分化形成芽苗。在本发明中，所述香蕉是用成熟香蕉去掉皮后放入榨汁机内加水打匀制成。[0055] 所述种子萌发培养环境条件为：先用黑色遮光布进行遮光培养40～90d，遮光率为80～100％；然后去掉遮光布，在光照强度为500～1000lx，光照时间为10～16h/d，温度为23～27℃，湿度60～70％条件下继续培养，获得生长健壮、具1～3张叶片和1～2条根系的离体芽苗。[0056] 本发明所述种子萌发培养后还可包括愈伤组织或类原球茎的诱导、继代增殖与分化培养的步骤，以提高组织培养效率。[0057] 本发明将芽苗进行修剪处理，包括剪掉叶片和根系，切成一个带顶芽和茎基的芽段，接种到诱导培养基中，所述诱导培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤0.5～1.0mg/l 2,4‑二氯苯氧乙酸0.5～2.5mg/l 香蕉10～30g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；更优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤0.6～0.8mg/l 2,4‑二氯苯氧乙酸1.0～2.0mg/l 香蕉20g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8，培养30～60d获得愈伤组织或类原球茎。[0058] 本发明将愈伤组织或类原球茎进行继代增殖培养，所述继代增殖培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0～4.0mg/l 吲哚丁酸0.1～0.3mg/l 香蕉10～30g/l 蔗糖20～30g/l，ph值为5.4～6.2；更优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤2.0～3.0mg/l 吲哚丁酸0.2～0.25mg/l 香蕉20g/l 蔗糖20g/l，ph值为5.8。在本发明中所述继代增殖培养为液体振荡培养，使用的是液体培养基，并置于转速50～110r/min的摇床上振荡培养，培养30～60d的增殖系数为6.8～10。本发明使用液体震荡培养，能增加培养液中的氧气供应，可以在短期内增殖得到大量的愈伤组织或类原球茎，有利于大量繁殖。[0059] 本发明将愈伤组织或类原球茎切割成小块后接种到分化培养基上，所述分化培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0～3.0mg/l 吲哚丁酸0.1～0.5mg/l 椰汁80～150ml/l 硝酸银0.5～1.0mg/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；更优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤2.0～2.5mg/l 吲哚丁酸0.2～0.3mg/l 椰汁100～120ml/l 硝酸银0.6～0.8mg/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8。培养60～120d获得芽苗。在本发明中，所述椰汁为新鲜椰子内部的汁液。[0060] 本发明所述愈伤组织或类原球茎的诱导、继代增殖与分化培养使用的光环境均为弱散射光照培养，光照强度为500～1000lx，光照时间为10～16h/d；培养温度为23～27℃，环境湿度为60～70％。[0061] 本发明将芽苗接种于壮苗与生根培养基上，所述壮苗与生根培养基优选为：1/2ms 萘乙酸0.2～1.0mg/l 香蕉50～100g/l 蛋白胨1.0～2.0g/l 蔗糖20～30g/l 琼脂3.0～4.0g/l，ph值为5.4～6.2；更优选为：1/2ms 萘乙酸0.5～0.8mg/l 香蕉60～70g/l 蛋白胨1.5g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8，培养90～120d获得完整植株。[0062] 本发明中壮苗与生根培养使用的光照强度为1500～3000lx，光照时间为10～16h/d；温度为23～27℃，环境湿度为60～70％。本发明在一步种子萌发培养和愈伤组织或类原球茎分化培养中获得的芽苗也能同步诱导出根系，但芽苗较弱，根系细短脆嫩易断，本发明对芽苗进行进一步的壮苗与生根培养，可获得芽苗粗壮、根系发达的完整植株，利于下一步的出瓶移栽。[0063] 本发明将完整植株进行炼苗，所述炼苗移栽季节优选为每年的3～5月或10～11月，炼苗场所为设施大棚内，自然光温下炼苗10～20d，然后打开瓶盖取出植株，洗净根部附着的培养基，用稀释1000倍的多菌灵浸泡2～3min，阴凉处晾置6～12h后，以1～3个单株聚集成一丛栽种到育苗杯中。所述育苗杯可选的为高7.0cm、口径8.5cm。所述移栽后的栽培基质优选为植金石、珍珠岩和松树皮按体积比为1：1：1～3。在本发明中，移栽后注意保持湿度和温度，移栽90d后，植株能产生新的根系，移栽成活率达90％以上，2～4年后能够在栽培中开花。[0064] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。[0065] 实施例1[0066] (1)天伦兜兰人工授粉及结实[0067] 在天伦兜兰原生居群中，分别选择盛花期花朵开放5d、10d、15d的健壮植株进行人工授粉，所述人工授粉为异花授粉(异株授粉)，具体为先用剪刀先把母本唇瓣的兜囊剪掉，再用牙签将父本的花粉囊涂抹在母本柱头面上，并套袋和挂牌标记，记录授粉日期和父母本性状。结果表明，天伦兜兰人工异花授粉容易成功，结实率为100％，果实饱满。如图1所示，为天伦兜兰在原生境中人工授粉结实。[0068] (2)蒴果的采收、消毒和无菌播种萌发培养[0069] 采收成熟度150dap的蒴果进行表面消毒，所述表面消毒具体为：先将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数70％的酒精浸泡60s，无菌水漂洗1次，再用有效氯含量为2％的次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水漂洗5次。然后用无菌滤纸把经过消毒处理的蒴果表面水分擦拭干，再用经过高温灭菌的刀具将蒴果纵向切开，将内部种子接种到萌发培养基表面，所述萌发培养基为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.5mg/l 萘乙酸0.1mg/l 香蕉30g/l 活性炭0.5g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.0g/l，ph值为5.8；培养环境条件为：先用黑色遮光布进行遮光培养，遮光率为80％，待种子萌发形成原球茎后使用弱散射光照培养，光照强度为500lx，光照时间为10h/d，培养温度为23～27℃，环境湿度为60～70％。结果表明，采用该表面消毒方法能达到较好的消毒效果，污染率为5％。播种35d时可见到萌发迹象，所述萌发是以种子变成白色的肉眼可见的突起为准，并逐渐膨大形成白色颗粒状原球茎，如图2所示，左为种子无菌萌发培养照片，右为电镜下观测的种子萌发形态照片。不转接继续培养，原球茎逐渐分化形成生长健壮、具1～3张叶片和1～2条根系的离体芽苗，如图3所示。[0070] (6)壮苗与生根培养[0071] 本发明将芽苗接种于壮苗与生根培养基上，所述壮苗与生根培养基优选为：1/2ms 萘乙酸0.2mg/l 香蕉50g/l 蛋白胨1.0g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8。培养条件为光照强度1500lx，光照时间为10h/d；温度为23～27℃，环境湿度为60～70％。结果表明，培养120d可获得具2～4片叶，株高达到2.5～4.0cm，根长1.0～1.8cm的完整植株。如图5所示。[0072] (7)炼苗与移栽[0073] 将瓶苗从培养室转移到温室大棚内炼苗10d，然后打开瓶盖取出植株，洗净根部附着的培养基，用稀释1000倍的甲基托普津浸泡3min，取出在阴凉处放置6h后进行移栽。移栽基质为植金石、珍珠岩和松树皮，先分别用清水浸泡充分后，按体积比为1:1:1混合均匀。以1～3个单株聚集成一丛移栽到高7.0cm、口径8.5cm的塑料育苗杯中，移栽后注意控制湿度、温度以及通风条件。结果表明，90d后植株能产生新的根系，移栽成活率达95％，在设施大棚中栽培管护2～4年后，植株能够正常开花。如图6所示，左为出瓶移栽90d照片，右为在栽培中开花照片。[0074] 实施例2[0075] 除实施例1所述步骤之外，在步骤(2)之后还包括步骤(3)～(5)：[0076] (3)诱导获得愈伤组织或类原球茎[0077] 将芽苗修剪掉叶片和根系并切成带顶芽和茎基的芽段后，接种到诱导培养基中，所述诱导培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤0.5mg/l 2,4‑二氯苯氧乙酸0.5mg/l 香蕉10g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8。在光照强度为500lx，光照时间为10h/d，温度为23～27℃，湿度为60～70％条件下培养。结果表明，培养30～60d可诱导获得愈伤组织或类原球茎，如图4a所示。[0078] (4)愈伤组织或类原球茎的继代增殖培养[0079] 将愈伤组织或类原球茎转接到继代增殖培养基上培养，所述继代增殖培养基为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0mg/l 吲哚丁酸0.1mg/l 香蕉10g/l 蔗糖20g/l，ph值为5.8，使用液体培养基置于转速50r/min的摇床上进行振荡培养，培养条件为光照强度500lx，光照时间为10h/d，温度为23～27℃，湿度为60～70％。结果表明，愈伤组织或类原球茎能够进行快速增殖，培养60d的增殖系数为6.8，如图4b、c所示。[0080] (5)愈伤组织或类原球茎的分化培养[0081] 挑选绿色愈伤组织或类原球茎切割成小块后接种到分化培养基上，所述分化培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0mg/l 吲哚丁酸0.1mg/l 椰汁80ml/l 硝酸银0.5mg/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8，培养条件为光照强度500lx，光照时间为10h/d，温度为23～27℃，湿度为60～70％。结果表明，培养60d后可逐步分化获得芽苗，如图4d、e所示。[0082] 实施例3[0083] (1)天伦兜兰人工授粉及结实[0084] 该步骤同实施例1。[0085] (2)蒴果的采收、消毒和无菌播种萌发培养[0086] 采收成熟度180dap的蒴果进行表面消毒，所述表面消毒具体为：先将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数75％的酒精浸泡80s，无菌水漂洗1次，再用有效氯含量为3％的次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水漂洗5次。然后用无菌滤纸把经过消毒处理的蒴果表面水分擦拭干，再用经过高温灭菌的刀具将蒴果纵向切开，将内部种子接种到萌发培养基表面，所述萌发培养基为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤2.5mg/l 萘乙酸0.3mg/l 香蕉40g/l 活性炭1.0g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.0g/l，ph值为5.8；培养环境条件为：先用黑色遮光布进行遮光培养，遮光率为90％，待种子萌发形成原球茎后使用弱散射光照培养，光照强度为800lx，光照时间为13h/d，培养温度为23～27℃，环境湿度为60～70％。结果表明，采用该表面消毒方法能达到较好的消毒效果，污染率为2％。播种40d时可见到萌发迹象，所述萌发是以种子变成白色的肉眼可见的突起为准，并逐渐膨大形成白色颗粒状原球茎，不转接继续培养，原球茎逐渐分化形成生长健壮、具1～3张叶片和2～3条根系的离体芽苗。[0087] (3)诱导获得愈伤组织或类原球茎[0088] 将芽苗修剪掉叶片和根系并切成带顶芽和茎基的芽段后，接种到诱导培养基中，所述诱导培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤0.8mg/l 2,4‑二氯苯氧乙酸1.5mg/l 香蕉20g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8。在光照强度为800lx，光照时间为13h/d，温度为23～27℃，湿度为60～70％条件下培养。结果表明，培养30～50d可诱导获得愈伤组织或类原球茎。[0089] (4)愈伤组织或类原球茎的继代增殖培养[0090] 将愈伤组织或类原球茎转接到继代增殖培养基上培养，所述继代增殖培养基为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤2.0mg/l 吲哚丁酸0.2mg/l 香蕉20g/l 蔗糖20g/l，ph值为5.8，使用液体培养基置于转速80r/min的摇床上进行振荡培养，培养条件为光照强度800lx，光照时间为13h/d，温度为23～27℃，湿度为60～70％。结果表明，愈伤组织或类原球茎能够进行快速增殖，培养60d的增殖系数为8.5。[0091] (5)愈伤组织或类原球茎的分化培养[0092] 挑选绿色愈伤组织或类原球茎切割成小块后接种到分化培养基上，所述分化培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤2.0mg/l 吲哚丁酸0.3mg/l 椰汁100ml/l 硝酸银0.8mg/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8，培养条件为光照强度800lx，光照时间为13h/d，温度为23～27℃，湿度为60～70％。结果表明，培养50d后可分化获得芽苗。[0093] (6)壮苗与生根培养[0094] 本发明将芽苗接种于壮苗与生根培养基上，所述壮苗与生根培养基优选为：1/2ms 萘乙酸0.5mg/l 香蕉70g/l 蛋白胨1.5g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8。培养条件为光照强度2000lx，光照时间为13h/d；温度为23～27℃，环境湿度为60～70％。结果表明，培养120d可获得具2～4片叶，株高达到3.0～4.0cm，根长1.0～2.0cm的完整植株。[0095] (7)炼苗与移栽[0096] 将瓶苗从培养室转移到温室大棚内炼苗15d，然后打开瓶盖取出植株，洗净根部附着的培养基，用稀释1000倍的甲基托普津浸泡3min，取出在阴凉处放置8h后进行移栽。移栽基质为植金石、珍珠岩和松树皮，先分别用清水浸泡充分后，按体积比为1:1:2混合均匀。以1～3个单株聚集成一丛移栽到高7.0cm、口径8.5cm的塑料育苗杯中，移栽后注意控制湿度、温度以及通风条件。结果表明，90d后植株能产生新的根系，移栽成活率达93％。[0097] 实施例4[0098] (1)天伦兜兰人工授粉及结实[0099] 该步骤同实施例1。[0100] (2)蒴果的采收、消毒和无菌播种萌发培养[0101] 采收成熟度210dap的蒴果进行表面消毒，所述表面消毒具体为：先将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉表面的灰尘和杂物，用体积分数80％的酒精浸泡90s，无菌水漂洗1次，再用有效氯含量为3％的次氯酸钠溶液浸泡15min，无菌水漂洗5次。然后用无菌滤纸把经过消毒处理的蒴果表面水分擦拭干，再用经过高温灭菌的刀具将蒴果纵向切开，将内部种子接种到萌发培养基表面，所述萌发培养基为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤3.5mg/l 萘乙酸0.5mg/l 香蕉50g/l 活性炭1.5g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.0g/l，ph值为5.8；培养环境条件为：先用黑色遮光布进行遮光培养，遮光率为100％，待种子萌发形成原球茎后使用弱散射光照培养，光照强度为1000lx，光照时间为16h/d，培养温度为23～27℃，环境湿度为60～70％。结果表明，采用该表面消毒方法能达到较好的消毒效果，污染率为3.5％。播种45d时可见到萌发迹象，所述萌发是以种子变成白色的肉眼可见的突起为准，并逐渐膨大形成白色颗粒状原球茎，不转接继续培养，原球茎逐渐分化形成生长健壮、具1～3张叶片和2～4条根系的离体芽苗。[0102] (3)诱导获得愈伤组织或类原球茎[0103] 将芽苗修剪掉叶片和根系并切成带顶芽和茎基的芽段后，接种到诱导培养基中，所述诱导培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤1.0mg/l 2,4‑二氯苯氧乙酸2.5mg/l 香蕉30g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8。在光照强度为1000lx，光照时间为16h/d，温度为23～27℃，湿度为60～70％条件下培养。结果表明，培养25～50d可诱导获得愈伤组织或类原球茎。[0104] (4)愈伤组织或类原球茎的继代增殖培养[0105] 将愈伤组织或类原球茎转接到继代增殖培养基上培养，所述继代增殖培养基为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤4.0mg/l 吲哚丁酸0.3mg/l 香蕉30g/l 蔗糖20g/l，ph值为5.8，使用液体培养基置于转速110r/min的摇床上进行振荡培养，培养条件为光照强度1000lx，光照时间为16h/d，温度为23～27℃，湿度为60～70％。结果表明，愈伤组织或类原球茎能够进行快速增殖，培养60d的增殖系数为10。[0106] (5)愈伤组织或类原球茎的分化培养[0107] 挑选绿色愈伤组织或类原球茎切割成小块后接种到分化培养基上，所述分化培养基优选为：1/2ms 6‑苄基腺嘌呤3.0mg/l 吲哚丁酸0.5mg/l 椰汁150ml/l 硝酸银1.0mg/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8，培养条件为光照强度1000lx，光照时间为16h/d，温度为23～27℃，湿度为60～70％。结果表明，培养45d后可分化获得芽苗。[0108] (6)壮苗与生根培养[0109] 本发明将芽苗接种于壮苗与生根培养基上，所述壮苗与生根培养基优选为：1/2ms 萘乙酸1.0mg/l 香蕉100g/l 蛋白胨2.0g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8。培养条件为光照强度2500lx，光照时间为16h/d；温度为23～27℃，环境湿度为60～70％。结果表明，培养120d可获得具2～4片叶，株高达到3.0～4.5cm，根长1.2～2.5cm的完整植株。[0110] (7)炼苗与移栽[0111] 将瓶苗从培养室转移到温室大棚内炼苗20d，然后打开瓶盖取出植株，洗净根部附着的培养基，用稀释1000倍的甲基托普津浸泡3min，取出在阴凉处放置12h后进行移栽。移栽基质为植金石、珍珠岩和松树皮，先分别用清水浸泡充分后，按体积比为1:1:3混合均匀。以1～3个单株聚集成一丛移栽到高7.0cm、口径8.5cm的塑料育苗杯中，移栽后注意控制湿度、温度以及通风条件。结果表明，90d后植株能产生新的根系，移栽成活率达90.5％。[0112] 对比例1[0113] 本对比例与实施例1不同之处在于：步骤(1)中，选择健壮开花植株进行人工自花授粉和自然授粉，所述人工授粉为授同朵花的花粉，并套袋和挂牌标记，记录授粉日期和母本性状；所述自然授粉为非人工辅助授粉，即自然状态下借助风媒、虫媒、水媒、鸟媒等方式的授粉。[0114] 结果表明，天伦兜兰人工自花授粉和自然授粉成功率极低，其中人工自花授粉未能获得结实，授粉后花朵很快萎蔫，结实率为0，自然授粉的结实率也仅为6.7％。本发明采用人工异花授粉的方法结实率高达100％，可显著提高天伦兜兰授粉结实率。[0115] 对比例2[0116] 本对比例与实施例1不同之处在于：步骤(2)中，表面消毒时使用升汞(hgcl2)溶液替代次氯酸钠(naclo)为主要消毒剂，具体为：将采收的蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，再用体积分数70～80％的酒精浸泡60～90s后，无菌水漂洗1～2次，然后用质量分数0.1～0.2％的升汞溶液消毒10～20min，无菌水漂洗5～6次(表1)。[0117] 表1不同成消毒方式种子萌发生长情况[0118][0119] 由上表1可知，本对比例的消毒方法能达到较好的表面消毒效果，污染率均低于5.0％，但萌发速度和萌发率存在差异，相较于使用常规消毒剂升汞，使用次氯酸钠为消毒剂能促进种子快速萌发，萌发时间提前了15～20d，且萌发率高达67.7％，更适用于天伦兜兰种子无菌播种萌发。[0120] 对比例3[0121] 本对比例与实施例1不同之处在于：步骤(2)中，使用的萌发培养基为：1/2ms 萘乙酸0.1mg/l 椰子汁100ml/l 活性炭1.0g/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.4。其余培养条件和方法都与实施例1相同。[0122] 结果表明，本对比例中培养60～90d得到原球茎，不转接继续培养50～80d，原球茎逐渐分化形成芽苗，但芽苗较细弱，易白化死亡。由此可见，本发明的萌发培养基可促进种子萌发、原球茎形成和分化培养速度，提高芽苗的健壮度。[0123] 对比例4[0124] 本对比例与实施例1不同之处在于：步骤(6)中，使用的壮苗与生根培养基为：1/2ms 萘乙酸0.5mg/l 椰子汁100ml/l 蔗糖20g/l 琼脂3.5g/l，ph值为5.8。其余培养条件和方法都与实施例1相同。[0125] 结果表明，本对比例中培养120d也可获得具根系的完整植株，但植株较矮，叶片较小，根长仅为0.5～1.0cm。由此可见，本发明的壮苗与生根培养基可促进芽苗粗壮和生根，更利于下一步的出瓶移栽。[0126] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

专利地区：广西

专利申请日期：2023-06-06

专利公开日期：2024-07-09

专利公告号：cn116897831b